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Protezione vascolare da clorochina durante la terapia tumore cerebrale con Tf-CRM107 Naoshi Hagihara. Stuart Walbridge. Alan W. Olson. Edward H. Oldfield. e Istituto Richard J. Youle 1 Biochimica e Sezioni clinica, chirurgica Neurologia Branch, Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo NHSWEHORJY, e in vivo NMR Centro di Ricerca Nazionale di Malattie Neurologiche e Stroke AWO, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20892 astratta Tf-CRM107 è un coniugato di transferrina e un punto mutante della tossina difterica che uccide selettivamente le cellule che esprimono alti livelli di recettore della transferrina. Tf-CRM107 è stato infuso intratumorally in pazienti con tumori cerebrali maligni. Anche se circa la metà dei pazienti presentano risposte tumorali, i pazienti trattati con dosi più elevate di Tf-CRM107 possono sviluppare immagini a risonanza magnetica (MRI) evidenza di tossicità indicativa di piccole trombosi nave o emorragia petecchiale. Coerentemente con questi risultati clinici abbiamo scoperto che l'iniezione intracerebrale di Tf-CRM107 in ratti a dosi totali 0,025 g provoca danni cerebrali rilevabili da MRI e istologia. Per ampliare la finestra terapeutica di Tf-CRM107, abbiamo esplorato modi per prevenire questi danni al sistema vascolare. Abbiamo concluso che il sistema vascolare può essere protetta in misura maggiore di tumore Tf-CRM107 infuse parenchima cerebrale da i. v. iniezione di reagenti a basso emato-encefalica permeabilità della barriera che bloccano la tossicità di Tf-CRM107. Clorochina, un farmaco antimalarico ben caratterizzato, blocca la tossicità della tossina difterica e Tf-CRM107. La somministrazione sistemica di clorochina bloccato la tossicità di Tf-CRM107 infuso intracerebrale nel ratto e ha cambiato la dose massima tollerata di Tf-CRM107 0,2-0,3 g. Inoltre, il trattamento clorochina completamente bloccato il danno cerebrale rilevata da MRI causato da infusione intracerebrale di 0,05 g di Tf-CRM107. Nei topi nudi che portano via sottocutanea gliomi U251, il trattamento clorochina ha avuto poco effetto sulla efficacia antitumorale di Tf-CRM107. Quindi, il trattamento clorochina può essere utile per ridurre la tossicità delle Tf-CRM107 per cervello normale senza inibire l'efficacia antitumorale e aumentare la finestra terapeutica di Tf-CRM107 per la terapia tumore al cervello. Introduzione La prognosi dei pazienti con tumori cerebrali maligni è scarsa nonostante la terapia standard (chirurgia, radioterapia e chemioterapia). Tf-CRM107 (1). un coniugato di Tf2 e un DT mutante privo di funzione del recettore vincolante (2). può avere come bersaglio e uccidere le cellule che esprimono Tf-R, come le cellule tumorali. Il potenziale di Tf-CRM107 per la terapia del tumore cerebrale è stata esplorata in vitro (1). in modelli animali (3). e in pazienti con gliomi maligni (4). Quando consegnato da alto flusso (410 l / min) microinfusion interstiziale CED (5). infuso intratumorale di Tf-CRM107 in pazienti con tumori maligni al cervello produce risposte tumorali (4). Quando si utilizza CED, Tf-CRM107 (140 kDa) è distribuito preferenzialmente nello spazio interstiziale del tumore e il cervello circostante infiltrati da tumore e aggira la BBB. Tuttavia, nel cervello, le cellule endoteliali dei capillari esprimono bassi livelli di (6) Tf-R. e ad alte dosi Tf-CRM107 può causare deficit neurologici coerenti con danno endoteliale. MRI in questi pazienti ha rivelato cambiamenti nel cervello coerente con occlusione microvascolare e / o emorragia petecchiale (4). Il nostro obiettivo era quello di proteggere selettivamente SNC capillari dalla tossicità Tf-CRM107 senza proteggere le cellule tumorali del cervello. Abbiamo cercato un farmaco a bassa permeabilità BBB che potrebbe essere consegnato i. v. per proteggere il sistema vascolare. ammine Lysosomotrophic, come la clorochina, sono usati clinicamente per curare la malaria e alcune malattie del collagene. Questi farmaci si accumulano nei lisosomi e aumento e neutralizzare il pH vescicolare (7). DT entra nella cellula per inibire la sintesi proteica, utilizzando il basso pH endosomi e lisosomi per innescare trasporto nel citosol (8. 9. 10. 11). Così, blocchi clorochina la citotossicità di DT (12) e probabilmente Tf-CRM107. Abbiamo studiato il potenziale di clorochina per migliorare l'utilità di immunotossine per la terapia del tumore al cervello per sopprimere selettivamente tossicità per il sistema vascolare senza alterare l'efficacia antitumorale. Materiali e metodi Linee cellulari e animali. La linea cellulare di glioblastoma umano U251MG e linea di cellule di ratto gliosarcoma 9L sono stati acquistati da American Type Culture Collection. Entrambe le linee di cellule sono state coltivate in mezzi DMEM con 10 FCS e mantenuti a 37 ° C in un ambiente 2 5 CO. Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti con maschi Fisher 344 ratti (Taconic), 2025 settimane di età, con un peso corporeo da 250 a 300 g e NIH nu / nu topi di sesso femminile di 46 settimane di età, che sono stati curati in conformità con le linee guida NIH. DT, Tf-CRM107, e clorochina. DT è stato acquistato da Lista Biologicals (Campbell, CA). Preparazione del CRM107 mutante DT e la coniugazione di Tf umana sono state eseguite come descritto in precedenza (1). La tossina e Tf erano legate da un legame tioetere. Clorochina difosfato sale (515,9 Da) è stato acquistato da Sigma (St. Louis, MO). Tossine e clorochina sono stati sciolti in PBS per esperimenti in vitro e in soluzione fisiologica allo 0,9 per esperimenti in vivo. Tf-R Espressione. Il mouse anticorpo monoclonale anti-Tf-R è stato acquistato da Zymed Laboratories (San Francisco, CA). Questo anticorpo (H68.4) è specifico per residui di 328 della coda Tf-R N-terminale umana e cross-reagisce con il ratto Tf-R. Il cervello normale, cervelletto, pons, midollo, ed il segmento cervicale del midollo spinale sono stati rimossi dai ratti, e tumori sono stati rimossi da ratti portatori 9L tumori cerebrali 14 giorni dopo l'inoculazione del tumore e congelato immediatamente in isopentano pre-raffreddata con ghiaccio secco. I tessuti congelati sono stati omogeneizzati con 1 Triton X-100 in PBS e centrifugato a 800 g. e il surnatante è stato salvato. La concentrazione di proteine di ogni campione di tessuto è stata determinata mediante il kit assay proteina BCA (Pierce, Rockford, IL). Pari quantità di proteine sono stati separati su 412 Tris-glicina Gel (Technology Novel Sperimentale, San Diego, CA) con un volume uguale di Tris-glicina SDS tampone 2X (NOVEX). Le proteine separate da pagina sono stati electroblotted su Immobilon PVDF membrane (Millipore, MA) che utilizzano TRNSBLOT (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Dopo aver bloccato con 0,05 Tween 20 (Sigma) in PBS (pH 7,4) contenente 5 FCS, le membrane sono state incubate con l'anticorpo primario per 1 ora a temperatura ambiente. Le membrane sono state poi lavate e incubate con rafano pecora coniugato con perossidasi antitopo anticorpi IgG (Amersham Pharmacis Biotech, Inc. Piscataway, NJ). Dopo lavaggio completo, le proteine immunoreattive sono state visualizzate mediante il sistema ECL secondo le istruzioni del fabbricante (Amersham). In Vitro citotossicità Assay. La tossicità di Tf-CRM107 per U251MG cellule dopo il trattamento clorochina è stata studiata utilizzando 14 Cleucine incorporazione come misura della sintesi proteica, come riportato in precedenza (1). Brevemente, dopo che le cellule sono state incubate con U251MG RPMI privo di leucina 1640 per 6 h, clorochina è stato aggiunto e incubato per 1 h. Diverse dosi di Tf-CRM107 (7 10 15 al 7 10 8 m) sono stati poi aggiunti 12 h dopo 0,1 Ci di 14 Cleucine stato aggiunto, l'incubazione è stata continuata per 1 h, e quindi le cellule sono state raccolte. Tutti i saggi di citotossicità sono state effettuate tre volte. I risultati sono stati espressi come percentuale del 14 Cleucine incorporazione nelle colture di controllo mock-trattato e sono stati espressi come media SE. Valutazione MTD. Dopo (iniezione intraperitoneale di 80 mg / kg ketamina e 12 mg / kg xilazina) anestesia, i ratti sono stati posti in un telaio stereotassico. Un'incisione sagittale mediana è stata fatta, e un trapano dentistico è stato utilizzato per posizionare un buco bava 3 mm laterali e 1 mm anteriore al bregma. Le tossine sono stati iniettati per la determinazione MTD in un volume di 5 l intracerebrale in topi a 1 l / min, con una siringa da 10 l Hamilton. DT è stato dato a raggiungere dosi totali di 0.0250.2 g, e Tf-CRM107 è stato dato per raggiungere dosi totali di 0.10.5 g. I ratti hanno ricevuto per via intraperitoneale iniezioni di entrambi clorochina (45 mg / kg n 41) o un veicolo (0,9 salina fisiologica n 39) 5 min prima dell'iniezione intracerebrale e una volta al giorno per 5 giorni consecutivi. Abbiamo osservato tutti i ratti per almeno 14 giorni. Se gli animali hanno mostrato segni di sofferenza (letargia, deficit neurologici, o l'incapacità di ottenere cibo e acqua), sono stati sottoposti ad eutanasia e decapitati, ed i cervelli sono stati rimossi immediatamente per l'esame istologico. Abbiamo preso in considerazione la dose massima di tossina iniettata intracerebrale che non causano disagio di essere il MTD. MRI. MRI è stata eseguita su ratti in anestesia (iniezione intraperitoneale di 80 mg / kg ketamina e 12 mg / kg xilazina) per rilevare danni cerebrali. Per la misura della tossicità in condizioni di infusione identiche alle misurazioni MTD, MRI è stata effettuata 3 giorni dopo l'iniezione con 0,4 g di Tf-CRM107 (1 l / min). Il protocollo usato su queste immagini era multistrato spin-eco fatto su una GE Omega 2 Tesla strumento foro orizzontale con 4 Gauss / cm gradienti schermati. L'immagine T1 pesate è stato preso con un TE / TR di 20/500 ms con un tempo di scansione totale di 8.5 min. Le immagini T2 sono state scattate con un TE / TR del 80/1500 ms con un tempo di scansione totale di 51 min. Ognuna di queste fette aveva una risoluzione digitale in piano di 390 m e spessore di strato 2 mm. Per rilevare il completo blocco della tossicità di Tf-CRM107 da clorochina nel cervello normale e al meglio il modello di metodo dell'infusione utilizzato negli studi clinici (CED), 0,05 g di Tf-CRM107 in 5 l sono stati infuso a 0,1 l / min con una pressione gradiente mantenuta utilizzando una pompa a siringa (Harvard Apparatus, S. Natick, MA), e la MRI è stata eseguita 14 giorni dopo l'infusione. Il protocollo usato su queste immagini era multistrato spin-echo fatto su un Varian Inova 4,7 Tesla strumento foro orizzontale con 15 Gauss / cm gradienti schermato. Queste immagini pesate in T2 sono state scattate con un TE / TR del 80/2000 ms fetta spessore era di 1 mm con 1,5 mm tra i centri fetta. Ognuna di queste fette aveva una risoluzione digitale in piano di 390 m. Tumore del modello. U251MG solido tumori glioma umano sono stati coltivati iniettando 10 7 cellule in coltura U251MG s. c. nei fianchi di topi nudi. tumori palpabili sono stati rilevati dopo 45 settimane e ha raggiunto 0.40.6 cm di diametro. Le dimensioni del tumore è stata valutata misurando due diametri perpendicolari con pinze Vernier e utilizzando la formula 1/2 LW 2. dove L è il diametro più lungo e W è il diametro perpendicolare a L. Gruppi di cinque topi nudi con tumori fianco U251MG stabiliti sono stati assegnati in modo random a ricevere iniezioni intratumorale con 100 l di una PBS o Tf-CRM107 (100 g / ml dose totale, 10 g), con o senza trattamento clorochina. I topi per via intraperitoneale ricevuto iniezioni di entrambi clorochina (45 mg / kg n 5) o di un veicolo (0,9 salina fisiologica n 5) 5 minuti prima iniezione intratumorale di Tf-CRM107 e una volta al giorno per 4 giorni consecutivi alla stessa dose. volume del tumore, valutata per 10 giorni, è stato rappresentato come percentuale del volume iniziale e espresso come media SE. Risultati e discussione Abbiamo confrontato i livelli di Tf-R in diverse regioni del cervello di ratto normale con il livello di Tf-R nei tumori cerebrali 9L. Il Tf-R è stato rilevato come un omodimero (180 kDa) su Western blots. cervello normale (cervello, cervelletto, pons, midollo, ed il segmento cervicale del midollo spinale) espressi Tf-R con qualche variazione in magnitudine tra le diverse regioni (Fig. 1 A. Lanes 15). I pons espresso particolarmente bassi livelli di Tf-R, forse riflettendo la densità capillare inferiore nella materia bianca di materia grigia. 9L tumori cerebrali di 14 giorni dopo l'inoculazione nel cervello dei topi sono stati anche esaminati. Il grado di espressione di Tf-R in tumori 9L era superiore a quello della normale CNS (Fig. 1 A. Corsia 6). A, analisi Western blot di Tf-R a Fisher 344 ratti. Trenta grammi di estratto di tessuto sono stati eseguiti su un 412 SDS-PAGE e colorati con un anticorpo anti-Tf-R (Zymed). I campioni di tessuto sono stati da ratto normale (Lanes 15), e ratti portatori 9L tumori cerebrali 14 giorni dopo l'inoculazione del tumore (Lane 6). 9L tumore cerebrale esprime più Tf-R rispetto al CNS. B. T1 MRI (a sinistra) e RM pesata in T2 (a destra) scansioni di cervello di ratto 3 giorni dopo l'infusione intracerebrale con 0,4 g di Tf-CRM107. La grande area del lavoro rappresentato emorragia ed edema coinvolti. La isointensità componente centrale sulla risonanza magnetica e bassa intensità T1 ponderate (indicato dalla freccia) sulla risonanza magnetica pesata in T2 rappresentato globuli rossi intatti con deossiemoglobina dopo emorragia. Il componente esterno (a bassa intensità in T1 pesate risonanza magnetica e ad alta intensità sulla risonanza magnetica pesata in T2) ha rappresentato l'edema. Quando 5 l di Tf-CRM107 sono state infuse nel cervello di ratto normale a 1 l / min, dosi totali di 0,025 g o danni cerebrali causati più come necrosi e encefalomalacia rilevato dal istologia per giorno 14 dopo l'infusione. Questi risultati sono stati in linea con le nostre precedenti relazioni (3). Abbiamo esaminato la tossicità Tf-CRM107 di cervello di ratto per la risonanza magnetica. MRI del cervello di ratto 3 giorni dopo l'iniezione intracerebrale con 0,4 g di Tf-CRM107 ha rivelato una lesione di massa con due componenti di diversa intensità di segnale nel lobo frontale destro. Il componente centrale è stata isointense sul T1 pesate risonanza magnetica e bassa intensità sul RM pesata in T2 (Fig. 1 B. Freccia). Questi modelli di risonanza magnetica sono coerenti con globuli rossi intatti contenenti deossiemoglobina dopo emorragia. Il componente esterno era bassa intensità sul T1 pesate risonanza magnetica e ad alta intensità sul RM pesata in T2 (Fig. 1 B), che indica l'edema con la grande area del lavoro che rappresenta emorragia ed edema coinvolti. Istologia della lesione ha mostrato emorragia con necrosi, perdita di tessuto, e l'invasione da parte dei macrofagi (dati non riportati). Questi cambiamenti nel cervello rilevata da risonanza magnetica e l'istopatologia indicano che Tf-CRM107 provoca danni vascolari. Tf-CRM107 a dosi elevate può legarsi al TF-Rs sulle cellule endoteliali dei capillari e causare la trombosi e quindi emorragico miocardico, o può causare emorragia direttamente come risultato di danno endoteliale. La clorochina è noto per bloccare la tossicità di DT in vitro (12). Abbiamo trovato clorochina in vitro bloccato la tossicità di Tf-CRM107 10100 volte, e ad una concentrazione di Tf-CRM107 7 10 11 m. le cellule sono state completamente protetti da 10 m clorochina (Fig. 2 A). A. tossicità di Tf-CRM107 per U251MG cellule di glioma umano dopo esposizione di 12 h con e senza clorochina (1, 10, e 50 m). La clorochina è stato aggiunto alle cellule 1 ora prima di Tf-CRM107. Tf-CRM107 senza clorochina () è il controllo. B. tasso di sopravvivenza dopo l'iniezione intracerebrale di tossine nei ratti. I ratti hanno ricevuto iniezioni nel lobo frontale destro con la dose indicata di DT e Tf-CRM107. I sintomi neurologici e la sopravvivenza degli animali sono stati monitorati. La percentuale di sopravvivenza degli animali è tracciata (tre a sette animali per gruppo). I ratti trattati con 0,4 g di Tf-CRM107 esposti segni clinici di tossicità. Abbiamo ipotizzato che la consegna sistemica di clorochina può proteggere il sistema vascolare del sistema nervoso centrale da TF-CRM107 e diminuire la tossicità del sistema nervoso centrale in vivo. Abbiamo esaminato la dose massima tollerata di Tf-CRM107 con e senza somministrazione clorochina. Dopo l'iniezione intracerebrale con 0,2 g di Tf-CRM107, nessun sintomo notevoli sono stati osservati in cinque su cinque ratti. Tuttavia, cinque (71) dei sette ratti che hanno ricevuto 0,3 g di Tf-CRM107 ha mostrato segni di sofferenza intorno al giorno 6 dopo l'iniezione. Cinque di cinque ratti che hanno ricevuto 0,4 g di Tf-CRM107 sono morti intorno al giorno 4. Tuttavia, se i ratti hanno ricevuto clorochina (45 mg / kg) in seguito ad iniezione con 0,3 g di Tf-CRM107, zero cinque animali ha mostrato segni di sofferenza. Sebbene 0,4 g di Tf-CRM107 con clorochina ha causato segni di sofferenza a quattro (80) di cinque animali, la clorochina ha aumentato il tasso di sopravvivenza e ha cambiato la dose massima tollerata di Tf-CRM107 da 0,2 ga 0,3 g (Fig. 2 B). Così, la clorochina sistemica protegge gli animali dalla tossicità cerebrale a causa di Tf-CRM107. infusione intracerebrale con 0,05 g di Tf-CRM107 ha causato danni cerebrali istologico (vale a dire, necrosi) nel lobo frontale destro di giorno 14. La tossicità a questa dose è stato rilevato come una lesione ad alta intensità su RM pesata in T2 (Fig. 3. sinistro ). amministrazione clorochina sistemica (45 mg / kg) completamente bloccato il danno cerebrale causato da 0,05 g di Tf-CRM107 al giorno 14 (n 3 Fig. 3. a destra). Risonanza magnetica pesata in T2 di un ratto che ha ricevuto una infusione intracerebrale con 0,05 g di Tf-CRM107 (10 g / ml) con 5 giorni per via intraperitoneale iniezione di clorochina (45 mg / kg destra) rispetto a un topo che ha ricevuto 0,9 salina fisiologica invece di clorochina (sinistra). Tf-CRM107 è stato microinfused a 0,1 l / min con una pompa a siringa. clorochina sistemica potrebbe proteggere il cervello del sistema vascolare da intracerebrale infuso Tf-CRM107. Se la clorochina potrebbe diminuire la tossicità di Tf-CRM107 senza diminuire l'efficacia antitumorale, una migliore terapia per i tumori del cervello può essere possibile. Il BBB può essere previsto per limitare la quantità di clorochina che può passare nel fluido cerebrale, le cellule tumorali balneazione cerebrali, e può impedire abbastanza clorochina di entrare nel cervello per bloccare l'attività antitumorale di Tf-CRM107. Il cervello di ratti e topi sono troppo piccoli per modellare accuratamente infusi tumore al cervello, pertanto, abbiamo utilizzato una misura sostitutiva di entrata clorochina nel cervello. Per valutare se abbastanza clorochina attraversa il BBB di inibire l'attività antitumorale di Tf-CRM107, abbiamo usato DT nativa che ha una sensibilità simile alla clorochina (1, 12). In contrasto Tf-CRM107, che colpisce le cellule endoteliali nel SNC, DT è selettivamente tossica per i neuroni nel cervello di ratto (13) e si rivolge a un tipo cellulare sul lato CNS della BBB come cellule tumorali cervello sono così. Abbiamo controllato l'effetto di clorochina sistemica sul tasso di sopravvivenza dei ratti iniettati intracerebrale con DT. Anche se nessuno dei quattro ratti che ha ricevuto 0,1 g di DT ha mostrato segni di sofferenza, tutti e quattro i ratti che hanno ricevuto 0,2 g di DT ha mostrato segni di sofferenza intorno al giorno 5. Quando clorochina è stata iniettata per via intraperitoneale a 45 mg / kg in aggiunta a 0,2 g di intracerebrale DT, tutti i quattro animali hanno mostrato segni di sofferenza intorno al giorno 5 (Fig. 2 B). Così, i. p. iniezione di clorochina non blocca la tossicità di DT intracerebrale. Anche se per via intraperitoneale iniezione di clorochina sembra raggiungere e proteggere il sistema vascolare del cervello da TF-CRM107, non protegge i neuroni del sistema nervoso centrale da DT. tumori cerebrali di intensificazione del contrasto possono avere un BBB parzialmente difettoso, e questo può consentire abbastanza clorochina nel tumore al cervello per bloccare l'efficacia Tf-CRM107. Abbiamo testato questa ipotesi, con un scenario peggiore di sistema vascolare del tumore che perde nella periferia. Abbiamo iniettato Tf-CRM107 in tumori U251 coltivate nei fianchi di topi nudi con e senza via intraperitoneale iniezione di clorochina. iniezione intratumorale di Tf-CRM107 crescita tumorale significativamente inibito rispetto a PBS (P 0,01), e per via intraperitoneale iniezione di clorochina a 45 mg / kg ha causato poco o nessun blocco dell'efficacia di Tf-CRM107 contro la s. c. tumorale (Fig. 4). Cambiamenti nella U251MG s. c. volume del tumore dopo infusione intratumorale di Tf-CRM107. Gruppi di cinque topi nudi con tumori fianco sono stati assegnati in modo casuale a essere iniettato intratumorally con 100 l di PBS o 100 l di Tf-CRM107 (dose totale, 10 g) con o senza via intraperitoneale trattamento clorochina. volume del tumore è rappresentato come percentuale del volume iniziale, valutato per 10 giorni ed espressa in bar medi. SE. Tf-CRM107 infuso intratumorally con alto flusso microinfusion interstiziale in pazienti con tumori cerebrali maligni ricorrenti causate almeno 50 riduzione del volume del tumore in 8 di 15 pazienti (4). Per migliorare questo risultato, abbiamo preso in considerazione i modi per aumentare la dose di Tf-CRM107 in modo sicuro in modo più efficace sradicare le cellule tumorali. In questo studio clinico peritumorale, lesione cerebrale focale si è verificato in tutti i pazienti che hanno ricevuto 40 g di Tf-CRM107 a 1 g / ml. L'analisi istologica delle biopsie rivelato trombosi venule e / o capillari corticali. Così, tossicità dose-limitante associata a intratumorale infusione Tf-CRM107 negli esseri umani è coerente con danni cerebrali capillare endoteliale. TF-Rs sono espressi sulle cellule endoteliali nel cervello normale (6). Sebbene la maggior parte Tf-Rs appaiono lume capillare (6). essi possono passare il cellulare al lato abluminale dove possono legarsi intracerebrale Tf-CRM107. Alte dosi di Tf-CRM107 possono causare infarto emorragico a seguito di trombosi nave diffusa o causa emorragia subito dopo legame con TF-Rs sulle cellule endoteliali dei capillari. l'infusione intracerebrale di Tf-CRM107 nel cervello di ratto a dosi 0,025 g causato danni CNS rilevato sia da istologia e la risonanza magnetica. Abbiamo rilevato danni MRI a 40 g (circa 0,8 g / kg) di Tf-CRM107 nell'uomo e 0,025 g (circa 0,1 g / kg) nei ratti. Questa discrepanza in MTD tra ratti e negli uomini può in effetti essere dovuto a differenze nella velocità di infusione o infusione volume relativo alla dimensione del cervello. Perché può essere plausibile per infondere continuamente ratti su 5 giorni a proprio infusi modello negli esseri umani, non siamo stati in grado di confrontare MTD direttamente tra ratti e gli esseri umani con la stessa tecnica di consegna. Abbiamo cercato di superare la tossicità dose-limitante di Tf-CRM107. Per proteggere i capillari normali da TF-CRM107, abbiamo identificato un farmaco che potrebbe bloccare Tf-CRM107. DT ha una serie di domini idrofobici (14, 15) che si inseriscono nelle membrane quando esposti al basso pH presente negli endosomi e lisosomi (8. 9. 10. 11). blocchi di clorochina la tossicità di DT aumentando e neutralizzando endosomali pH (7, 12) e blocchi la tossicità di Tf-CRM107. La clorochina può anche aumentare la sopravvivenza dei topi dopo l'infusione intracerebrale Tf-CRM107 e previene i cambiamenti MRI associati alla tossicità. Il segnale ad alta intensità sulla risonanza magnetica pesata in T2 dopo l'infusione di Tf-CRM107 può riflettere il danno istologico a causa di capillari trombosi o emorragia petecchiale. In generale, MRI T2 ponderata è molto sensibile per la rilevazione di questo tipo di danno cerebrale. trattamento clorochina animali protetti da questo danno causato da Tf-CRM107. Abbiamo considerato la misura in cui la clorochina attraversa la BBB. I fattori più importanti che determinano la somministrazione di farmaci dal sangue in CNS sono liposolubilità, massa molecolare, e la carica (16). Il normale BBB inibisce il passaggio di farmaci idrosolubili con una massa molecolare superiore a 180 Da. Clorochina (516 Da) è facilmente solubile in acqua e insolubili in alcool, benzene, cloroformio o etere. I nostri esperimenti hanno rivelato che la clorochina non ha modificato la dose massima tollerata di intracerebrale iniettato DT e non ha ridotto il danno cerebrale istologico in ratti che hanno ricevuto DT (dati non riportati). D'altra parte, clorochina fatto bloccare la tossicità di intracerebrale iniettato Tf-CRM107. Le diverse sensibilità di intracerebrale DT e Tf-CRM107 alla clorochina sistemica supporta il modello che Tf-CRM107 è specificamente di mira le cellule endoteliali dei capillari. Clorochina non attraversa la BBB in misura sufficiente per bloccare DT e quindi non dovrebbe bloccare l'efficacia antitumorale di Tf-CRM107 iniettati intracerebrale. Abbiamo studiato se direttamente clorochina ha inibito l'efficacia antitumorale di Tf-CRM107. La BBB è intatto ai bordi proliferazione di tumori maligni al cervello e nelle regioni del cervello, infiltrati, ma è più permeabile al centro (17). In pratica, gli studi clinici con tomografia computerizzata rivelano che BBB permeabilità è variabile nei tumori cerebrali (18). Abbiamo trovato qui che il trattamento clorochina provoca poco o nessun blocco dell'efficacia di intratumorale Tf-CRM107 anche in s. c. tumori del tutto privo della BBB. La BBB dovrebbe minimizzare ulteriormente l'accesso alla clorochina tumori cerebrali. Sembra che la clorochina può bloccare la tossicità per il sistema vascolare con scarso effetto sull'efficacia antitumorale di Tf-CRM107 in cervello. Sebbene alcuni effetti collaterali sono noti, clorochina è stato generalmente considerato sicuro e può essere assunto per via orale Undici volontari sani dato 300 mg di clorochina come una singola dose di i. v. infuso lamentava solo di effetti collaterali soggettivi, come ad esempio le difficoltà di deglutizione e di alloggio, diplopia, e la fatica durante i. v. infusione non sono stati osservati effetti sulla elettrocardiogramma, media pressione arteriosa, frequenza del polso o (19). I pazienti non sono in grado di prendere dosi orali potrebbero essere date clorochina per lenta i. v. infuso o per via sottocutanea o i. m. iniezione (20). La tomografia computerizzata e studi di risonanza magnetica utilizzando i. v. contrast enhancement definire la posizione dei tumori cerebrali a causa di perdite mezzi di contrasto da regioni prive di un BBB intatto. Sebbene la resezione del tumore viene eseguita nel modo più preciso possibile secondo scansioni della lesione migliorando, il bordo proliferante di tumore non contrastare migliorare perché la BBB rimane intatto e cellule tumorali sono noti ad invadere centimetro oltre la lesione miglioramento (21. 22. 23) . Dopo la resezione chirurgica, questo tumore residuo nelle aree con una BBB intatto è il fattore principale alla base del fallimento delle attuali trattamenti di questi pazienti. Tf-CRM107 può infine essere meglio utilizzato subito dopo l'intervento chirurgico per il trattamento di questa regione del cervello tumore-infiltrati dopo la resezione di tutto il volume di intensificazione del contrasto. In questa situazione, clorochina deve essere fortemente limitato dal tumore dal BBB intatta. Il i. v. iniezione di clorochina durante l'infusione intracerebrale di Tf-CRM107 può proteggere il sistema vascolare, permettendo meno tossicità per il cervello mentre consentendo maggiori dosi di Tf-CRM107 da consegnare al tumore per migliorare ulteriormente il tasso di risposta di questa nuova terapia del cancro. Ringraziamenti Ringraziamo Pat Johnson per l'assistenza e Daryl Despres per la competenza nella manipolazione MRI.
